Az agaróz géleket a molekuláris biológiában
a nukleinsav-töredékek szétválasztására és tisztítására használják.
Festéssel a töredékek láthatóvá tehetők ultraibolya fényben.
A mintákat a gél zsebeibe töltjük,
és méret szerint szétválasztjuk
elektromos áram segítségével.
Az agaróz gélen szétválasztható töredékek mérete
kb. 0,2-20 kilobázis között van.
Az agarózból készíthető gélek
koncentrációja 0,6-3 % között változhat
a szétválasztandó töredékek méretétől függően.
A kisebb töredékek jobban szétválnak,
ha a gélben magasabb az agaróz koncentrációja.
Nagyobb töredékek szétválasztására pedig
a kisebb agarózkoncentráció alkalmas.
Az agaróz gélt két fő összetevő alkotja.
Az agaróz, amely egy fehér por,
és a pufferoldat.
Ezeket összekeverve kell melegíteni a gél elkészítéséhez.
GÉLKÉSZÍTÉS
Az agaróz gél elkészítéséhez
kimérjük a megfelelő tömegű agarózt,
és a megfelelő térfogatú pufferoldatot
a készítendő gél mérete és benne lévő agaróz koncentrációja alapján.
Keverjük el az agarózt és a pufferoldatot
csomómentesen az edényben.
Ezután melegítsük a keveréket mikrohullámú sütőben,
amíg az agaróz teljesen fel nem oldódik.
Figyeljünk arra, hogy az edény elég nagy legyen ahhoz,
hogy az oldat forrás közben
ne fusson ki belőle.
A fedelét lazán helyezzük rá,
hogy megelőzzük az oldat kifutását.
Nagyon fontos, hogy a fedél laza maradjon,
különben veszélyesen megnőhet a nyomás az edényben.
Melegítés közben időnként keverjük meg az oldatot.
Ehhez használjunk védőkesztyűt.
Az oldat túlhevülhet,
ezért keverés közben hirtelen felforrhat.
Az agaróz oldódása csak akkor teljes, ha tökéletesen átlátszó.
Ha az agarózt nem oldjuk fel teljesen,
a kész gélben a koncentráció nem lesz egyenletes,
és a nukleinsav minták nem válnak szét megfelelően.
Mikor az agaróz teljesen feloldódott,
hagyjuk lehűlni 60 Celsius fokra,
hogy a hő ne károsítsa a géltartályt,
de a gél még folyékony maradjon.
Mikor az agaróz lehűlt,
színezéket kell adni az olvadt gélhez,
ami majd láthatóvá teszi
a méret szerint szétválasztott nukleinsav-töredékeket.
Használhatunk Sybr Greent,
de a legjobb és leggyakoribb festék az etídium-bromid.
Etídium-bromid használatakor
mindig kesztyűt kell viselni,
mivel mutagén és karcinogén anyag,
amely a bőrön át és belélegezve is bejuthat a szervezetbe.
Etídium-bromiddal végzett munka után rögtön váltsunk kesztyűt,
hogy ne szennyezzük be a többi eszközt a laborban.
GÉLÖNTÉS
A géltálcáknak két nyitott vége van,
amelyeket le kell zárni, amíg a gél megszilárdul.
Ez maszkolószalaggal könnyen megoldható.
Vegyünk egy darab szalagot,
amely néhány centivel hosszabb,
mint a géltálca nyitott vége.
Hajtsuk be a szalag végét, hogy később könnyen el lehessen távolítani.
Ragasszuk a szalagot a tálca végére úgy,
hogy mindkét oldalon túlnyúljon rajta,
és szorosan simítsuk rá.
Végezzük el ugyanezt a másik végén is.
A gélöntés előtt tegyük a géltálcát vízszintes felületre,
hogy a gél vastagsága egyenletes legyen.
A géltálcába egy fésűt illesztünk.
A fésű mélyedéseket alakít ki, amelyeket zsebeknek nevezünk.
Ezekbe a zsebekbe fogjuk pipettázni a nukleinsav-mintákat.
Ha a géltálca vízszintes, és belehelyeztük a fésűt,
lassan öntsük a gélt a tálcába.
Egy eldobható pipettaheggyel
húzzuk félre az esetleges buborékokat.
Különösen fontos, hogy a fésű mellett ne maradjon buborék,
mert ez befolyásolhatja a zsebek alakját.
Kb. 20 percig tart, amíg a gél megszilárdul,
ezalatt átlátszóból opálossá válik.
Ezalatt ne mozgassuk a géltartályt,
és ne érjünk a gélhez,
különben a vastagsága nem lesz egyenletes.
Ha a gél megszilárdult, kivehetjük a fésűt.
Óvatosan fölfelé húzva, függőlegesen emeljük ki.
A kihúzás közben érezhető egy kis ellenállás.
Ezután távolítsuk el a maszkolószalagot a tálca végeiről.